酵素作用的新媒介

──有機溶劑

【摘要】傳統觀念認為酵素在有機溶劑中容易變性，因此不能在其中進行催化作用，然而最近的研究發現酵素在有機溶劑中反比在水溶液中安定，而且具有不同於水溶液中的特性。

酵素催化作用的優點

以酵素作為觸媒有許多優點：一﹒催化效率很高，比化學催化劑大約快10⁸~10¹¹倍，可在溫和條件下進行高效率催化作用；二﹒轉換程度高，副產物及污染物少；三﹒特異性（specificity）高，具立體特異性（stereospecificity），可區別光學異構物如D-、L-型胺基酸；具位置特異性（regiospecificity），如可區別甘油之三個羥基；受質特異性高的酵素，可在複雜樣品中檢驗特定物質不受干擾，特異性廣的酵素可應用於轉換具工業利益之非天然受質，如葡萄糖異構天然受質為木糖，但亦可將葡萄糖轉換為果糖。

長久以來酵素被視為只能在水溶液中作用，因此大大限制了酵素應用的範圍。其實有些酵素在有機溶劑中進行催化作用，遠比在水溶液中有利，因一﹒許多有機物難溶於水而易溶於有機溶劑；二﹒水常參與不良副反應；三﹒從熱力學平衡的觀點來看，許多反應在水溶液中不利產物形成；四﹒因水的沸點高，一般產物自水溶液中回收困難且成本高。所以如能以酵素在有機溶劑中作用，對酵素的應用將是一大突破。

細說發展歷史

一般認為有機溶劑易使酵素變性，因此不能在有機溶劑中進行催化反應。雖早在1966年，普萊斯（Price）等人發現凝乳胰蛋白與黃嘌呤氧化（xanthineoxidase），可在有機溶劑中保持催化活性，但當時並未引起太大注意；後來1977年，克立巴諾夫（Klibanov）等利用凝乳胰蛋白，在有機溶劑中催化乙醇與N-乙醯基-L-色胺酸，合成N-乙醯基-L色胺酸乙酯，在有機溶劑中應用酵素合成有機物的潛力，開始引起大家的重視。後來，陸續提出幾種不同反應系統。1978年馬蒂內克（Martinek）等人發現，α-凝乳胰蛋白及過氧化，可以在界面活性劑AOT（1，2-雙〔2-乙基己基氧羥基〕-1-乙烷磺酸鈉）構成之逆微膠粒（reverse m-icelle system）中保持活性，過氧化在此系統中活性較在水溶液高得多；1980年庫爾（Kuhl）等人利用水溶液－有機溶劑的兩相系統合成胜。最近稻田（Inada）等人利用化學修飾法，將脂肪、脂蛋白脂肪及過氧化，修飾成聚乙二醇衍生物，催化此種修飾過的酵素，可溶於有機溶劑且保持高活性。

以上系統有的仍需要水的參與（兩相系統），有的需要添加界面活性劑（逆微膠粒系統），有的需要經過複雜的酵素修飾步驟，因此在應用上仍有不便之處。最近麻省理工學院克立巴諾夫發現，在近乎無水狀態下（＜1％水分），酵素可以在有機溶劑中保有活性而且比在水溶液中穩定，同時由於酵素不溶於有機溶劑，因此可以不經固定化而重複使用，此一突破性的發現，為酵素在有機合成與化學工業等方面的應用，拓展了新的領域。

可保持活性的原理及必需的條件

酵素需要水分才可具有催化活性是無可爭議的，因水直接或間接參與一些「非共價」的作用（如氫鍵、靜電作用、疏水性與凡得瓦作用等），以維持具有催化功能之酵素構形。然而，維持酵素功能所必需的水分，應僅包圍在酵素分子約一單層（mono layer）之水分，因此只要酵素保有此一「必要」的水分，其餘水分以有機溶劑取代，應不致影響酵素活性；蓋酵素活性需之水分相當微量，所以酵素應可在幾近無水之有機溶劑中進行反應。

選擇合適酵素的條件如下：

一﹒酵素所作用的受質必須能溶於有機溶劑；

二﹒於酵素反應過程中，水並非為反應物；

三﹒一般輔基（cofactor）不溶有機溶劑，所以應選擇不需輔基的酵素。

目前已使用於有機溶劑中進行催化作用的酵素有：蛋白、黃嘌呤氧化、多酚氧化嘌、過氧化及脂肪等。

選擇最佳的有機溶劑：選擇溶劑的首要條件是，考慮溶劑性質是否能維持酵素構形的「必需水分」。溶劑以親水性及疏水性可分為三類。第一類：如苯、甲苯、氯仿等是屬非常疏水性溶劑，與水完全不互溶，故不會搶走酵素必需水，這類有機溶劑較適合使用。第二類：如乙酸乙酯、乙酸丁酯屬疏水性較差溶劑，但不會完全和水互溶，雖然這類溶劑會奪取酵素必需的水層，但只要事先以水預先飽和這類溶劑，則仍能適用。第三類：如丙酮、甲醇是屬於非常親水性溶劑，可與水無限互溶，無法用水來預先飽和，故使用這類溶劑易奪取酵素之必需水層而導致酵素變性。

大部分酵素在第三類的溶劑中，雖多難保特活性，但與酵素本質有關，如豬胰臟脂肪對酵素必需水層的吸附非常緊，不易被溶劑奪走此層水，故豬胰臟脂肪於親水性及疏水性的溶劑中均保有活性。大部分酵素是不溶於有機溶劑的，且以懸浮狀態存在，這種不溶現象，可避免酵素於有機溶劑中產生不同構形，使其構形不論在水中或有機溶劑中均相同，故酵素在有機溶劑中仍具活性。而如二甲基亞及二甲基甲醯胺，因這類溶劑會把酵素完全溶解，使酵素構形完全改變，而使酵素變性。

選擇適當的酸鹼度：酵素在水溶液中的活性受pH值影響，而酵素在有機溶劑中的活性是否與pH值有關呢？這可以豬胰臟脂肪的實驗來說明。把酵素溶於各種不同pH值的氯化鉀緩衝溶液中，分別製成丙酮粉，把這些在不同pH值沈澱的丙酮粉，分別置於有機溶劑及水溶液（調好pH＝8.4氯化鉀緩衝溶液），再加受質進行催化作用。結果在水溶液中酵素活性不受酵素沈澱時pH值的影響，因酵素沈澱pH之值已受水溶液中緩衝溶液的pH值影響。但於有機溶劑中作用的酵素活性，就深受酵素沈澱時pH值影響，因為酵素解離基（iongenic group）會依所給之pH值產生某種解離態，即使把酵素置於有機溶劑中，仍會保留該解離態，故沈澱時該酵素之pH值會造成一種記憶，深深影響酵素於有機溶劑中的活性。以枯草桿菌蛋白，於正辛烷（octane）中來進行N-乙醯基-L-苯丙胺酸乙酯與丙醇的「交酯化作用」（transesterification），若把進行酵素沈澱時之溶液調至其最適之pH值，則催化速率會增大300倍。

使非均質（heterogeneous）催化作用達到最小：酵素在有機溶劑是以懸浮粒存在，若酵素之比活性很高，則懸浮粒狀態會產生非均質催化作用（即受質只能和外圍酵素分子作用，而受質無法深入內部，故無法與內部酵素分子作用，使內部酵素無法完全發揮作用，導致酵素顆粒外圍與內部的催化力不同）。

下列方法可盡量減少酵素內外催化力不同的現象：一﹒把酵素固定在多孔載體（porous carrier），增加接觸表面積；二﹒利用超音波震盪器把酵素的懸浮粒震至最小顆粒；三﹒以聚乙二醇共價法（covalent）修飾酵素，達到分散酵素目的。

故只要選擇合適的酵素，使用可保留酵素必需水層之有機溶劑，於最適當的pH值下沈澱酵素，並使酵素懸浮粒盡量減小，則酵素就可在有機溶劑中充分作用，這種方法更可拓展酵素應用的領域。

有機溶劑中作用產生新性質

產生新反應

昔日酵素應用大多是利用酵素的天然性質，但如把酵素置於有機溶劑中則會產生新反應。以脂肪為例，脂肪在水溶液中是進行水解反應，把三甘油酯水解為甘油和脂肪酸，這乃因水為三甘油酯水解的反應物，於水溶液中因水分子非常多使反應會趨向水解，但若是在有機溶劑中則有利於合成反應，如脂肪在有機溶劑中能進行交酯化反應、酯化反應、胺解反應（aminolysis）、醯基交換（acyl exchange）；交硫酯反應（thiotransesterification）及解反應（oximolysis）。

使酵素熱穩定性較水溶液中為佳

酵素的活性中心乃藉著氫鍵、疏水鍵、離子鍵及凡得瓦力構成平衡而維持的，當溫度上升這些力量就會減少，使構成酵素活性中心的胺基酸原是聚集的，因支撐力量瓦解，造成活性中心散開而失去活性。酵素熱變性的機制如下：

一﹒共價鍵改變

（一）雙硫鍵變化：β-消去反應

1. 雙硫鍵藉著β-消去反應而產生還原反應；

2. 含胱胺酸及半胱胺酸的酵素，形成新的分子間或分子內的雙硫鍵；

3. 雙硫鍵水解形成硫半胱胺酸（thiocysteine）及去氫丙胺酸（dehydroalanine）：

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（二）胺基變化：尤其是指離胺酸之ε-胺基

1. ε-胺基去攻擊去氫丙胺酸而形成離胺酸基丙胺酸；

2. ε-胺基與天冬胺酸或胺酸上的羥基形成異胜鍵（isopeptide bond）；

3. ε-胺基與醛基形成Schiff's鹼基。

（三）酵素經過加熱，構形散亂，更易受蛋白攻擊。

二﹒非共價鍵改變

（一）酵素濃度很高則形成聚合體：酵素之疏水區本來是在內部，但散亂後就暴露於外面，這種現象與熱力學不符，為了降低自由能，則散亂的酵素分子會彼此作用，於是疏水區部分就會相互作用而形成聚合體。

（二）酵素濃度低時則形成不正確之構形：散亂的酵素因酵素濃度低，為符合動力學及熱力學要求，則散亂酵素會再自行摺疊，但是所形成構形不具催化活性。

由上述酵素於高溫變性的機制，可知很多反應都需要水參與（如水解反應、β-消去反應及非共價鍵改變）。水對酵素而言是一種潤滑劑，使得酵素在水中具有高度構形變化作用（因水會影響酵素的鍵結，而改變酵素構形），若將水分去除，則會使得酵素變得較剛硬，使酵素構形不易改變。所以如在無水環境中，變性反應就不易進行，由豬胰臟脂肪的熱變性可得到證明，此脂肪於100℃的水溶液下加熱立刻變性，若置於有機溶劑中於100℃下加熱，則其半衰期可長達十小時。由此可證明在低水分有機溶劑中，酵素的構形非常穩定。

改變酵素受質特異性

以脫水方法使得酵素構形變得剛硬，如此可改變酵素受質特異性。以豬胰臟脂肪為例，濕的脂肪（含3.6%水分）因水分較多，具有高度構形變化作用，故酵素分子形態的彈性較大，可同時接受一級、二級或三級醇各種大小不同的受質。而乾的脂肪（含0.48％水分則因酵素分子較剛硬，其活性中心無法張得太開，所以只能接受一級或二級醇等較小的受質，而無法與三級醇這種大分子的受質作用。

另外，還可以有機溶劑代替水來改變酵素受質特異性，酵素與受質結合的主要驅動力之一為疏水性作用。設若有一種親脂性受質在水溶液中作用，則在水中會產生排擠力，若把親脂性受質推向酵素活性中心。者在有機溶劑中則這種排擠力不存在，因此可影響酵素對受質的結合特異性。如凝乳胰蛋白在水溶液中，對N-乙醯基-L-苯丙胺酸乙酯（N-APEE）之水解力為N-乙醯基-L-組織胺酸乙酯（N-AHEE）的一千倍。凝乳胰蛋白於正辛烷中其受質特異性改變了，N-AHEE反而是比N-APEE好10倍的酵素受質。

酵素在有機溶劑中的應用

應用在有機合成方面

許多傳統有機合成法可以酵素法取代，茲舉數例說明如下：

一﹒乙二醇（primary monoester glycol）一級單酯的合成──利用乙二醇來做為有機合成過程中，被合成物的保護劑，因此是有機合成上重要的化合物，尤其是乙二醇一級單酯更具有選擇位置的修飾作用。所以合成乙二醇一級單酯在有機化學上，是相當重要的。以傳統化學方法可得到35∼40％的乙二醇一級單酯，若是以豬胰臟脂肪於乙酸乙酯中進行此反應，則可得到80∼90％的乙二醇一級單酯，這乃利用豬胰臟脂肪對乙二醇初級羥基（primary hydroxyl group），具有位置特異性的效用。

二﹒2,3,4,6-葡萄糖四乙酸酯的合成──2,3,4,6-葡萄糖四乙酸酯於醫藥與農藥製造上為常用的中間體。日本專利公布化學合成法，可得到75％的2,3,4,6-葡萄糖四乙酸酯。筆者發現，Aspergillus niger脂肪**在室溫水溶液中，可以水解葡萄糖四乙酸酯為2,3,4,6-葡萄糖四乙酸酯，其產率也是75％，但將這種水解作用在水－有機溶劑兩相系統中進行，可以改變脂肪對葡萄糖五乙酸酯的水解特異性，使產率達93％；若進一步將此脂肪放在純而乾燥醇類中進行醇解作用，則葡萄糖四乙酸酯之產率可趨近100％。此酵素法比化學法優越，蓋不但產率提高而且可節約能源及設備。

三﹒Dopa〔即3,4-雙羥基苯丙胺酸（3, 4-dihydroxy phenylalanine）〕的合成──Dopa可作為治療巴金森氏症之用。多酚氧化對芳香族化合物，具有位置選擇性的氧化作用：【瀏覽原件】
但所產生的鄰（O-quinone），在水溶液中很不穩定，會自行聚合，並且，多酚氧化會和鄰進行1,4-麥可加成反應而使酵素變性。若將多酚氧化於氯仿中進行催化反應，在氯仿中可防止鄰聚合反應：N-乙醯基-L-酪胺酸乙酯+O₂【瀏覽原件】
因此，可利用維生素C把鄰還原為Dopa。而且輔受質（cosubstrate）O₂在氯仿中的溶解度較水中為佳，故可提高Dopa產率至71%。

四﹒脂肪可用於三甘油酯之位置特異性交酯化反應──利用此反應可將具1,3位置特異性的脂肪，將低價值橄欖油轉變為高價值之可可脂。而脂肪也具立體特異性，可用於分離消旋混合物→（racemin mixture），也可作用於內消旋物質（mesosubstrate），以得到具單一光學活性的酯類、醇類，或羧酸類的化合物。

應用於分析難溶於水的有機物

昔往受酵素需在水溶液作用的觀念束縛，因而酵素分析只限於水可溶物質。但自從確定酵素可在有機溶劑中作用後，擴大其範圍至水難溶之有機物。例如，膽固醇分析通常利用雙酵素偶合反應（coupledbienzymic system）：

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若膽固醇以磷酸緩衝溶液萃取，再經過濾處理，所得之可溶物再經雙酵素偶合反應，以對－甲氧苯胺為呈色劑，則其在波長458.5nm下的吸光值為0.05（比統計信賴值低）。若以甲苯萃取，則可直接於甲苯中進行雙酵素偶合反應，結果得到的吸光值為1.78。由此可知將酵素置於有機溶劑中，可完成在水溶液中無法執行的微量定量分析，並且可利用具有選擇性的有機溶劑，來萃取分析特定的物質，並可免除分析時受其他物質的干擾。

未來展望

酵素可以在有機溶劑中進行催化作用的現象，可能適用於所有酵素，因為目前試驗過的十多種酵素中（儘管它們的結構、大小、來源、功能等均有相當大的差異），均證明可以在有機溶劑中作用。由於酵素在有機溶劑中不但可催化許多不同種類的反應，而且具有一些新的特性，因此使酵素應用的範圍更為廣闊，預料未來許多傳統有機合成法將為酵素法所取代，而將革命性地改變某些化學工業與製藥工業的流程。

未來酵素可能拓展應用的方面包括：石油化學物質的轉化、聚合反應、植物油與動物油脂的轉化、氣體與難溶於水有機物的酵素感測器、選擇性去除物質中的不良成分（例如去除石油中之硫）以及酵素在超臨界流體（supercritical fluid）中的作用等。配合蛋白質工程技術的發展，可望未來可以設計生產任何具有特定功能與高穩定性的酵素。我們相信，酵素應用的前途無可限量。

參考資料

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朱惠鈴任教於嘉南藥專；蕭介夫任職於中央研究院植物所

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