細胞系的建立及其應用


1988年05月221期｜上一篇｜下一篇＃發行日期：1988、05 ＃期號：0221 ＃專欄：＃標題：細胞系的建立及其應用＃作者：鄧文炳．細胞與生物個體的關係．活體外細胞系的建立．細胞培養方法．實驗室的基本設備．細胞系的應用．表一：已培養成延續細胞系的動物及細胞系數目。．表二：細胞的培養方式及其特性。．圖一：細胞由「活體內」轉移到「活體外」培養。．圖二：新細胞至實驗測試的培養例行工作。		細胞系的建立及其應用【摘要】我們不可能直接以人體去測試一些外界因子（如輻射、化學、藥物等）對人體的效應，細胞系是很好的工具，它可以給我們很多訊息。人是個生物個體，可是我們很難想像人是由上億的細胞和它的衍生物所「黏」成的；而且無法以肉眼觀察的細胞，對我們說來更覺得抽象。由於細胞是個體所組成的最小單位，因此細胞所產生的不正常變化將是個體變異的先兆。所以，將細胞培養在人為控制的環境下，可間接探測外界因素對個體的影響。從本世紀初起，「細胞培養技術」（cell culture technic）在生物實驗室中就一直扮演很重要的角色。細胞培養最大的利益是，「細胞的分裂」能在我們控制的環境下進行，更可以廣泛應用。目前已經有四百多種細胞成功地從「活體內」（in vivo）轉移到「活體外」（in vitro）培養而建立成細胞系（cell line）。這些細胞系有初級細胞系、延續細胞系及有限生命細胞系三大類。在培養方面，依細胞特性和實驗目的已經發展成三種細胞培養方式：單層培養（monolayer culture）、懸浮培養（suspension culture）、超小粒固定化培養（superbead microcarries culture）等。目前在生物實驗中，有關細胞系建立的技術都已相當成熟，而建立細胞實驗室進行細胞生物學的研究，是從事基礎醫學最重要的奠基工作。細胞與生物個體的關係生物個體的形成，不論是動物或植物，都是由上億的細胞所組成，起初是由一個單細胞──受精卵，循著一定的生理規律分裂生長。細胞是有生命的，且帶有特定遺傳質體（specific genetic plasma），由前一代傳到下一代。利用顯微鏡可將個體內上億的細胞分辨出許多種不同的類型。個體的發育必須經過兩個大步驟：第一，由受精卵增殖分裂產生大量的細胞，此過程中需發生數百萬次的分裂；第二，細胞生長繁殖到某階段時，必須在各不同部位，精確分化成不同功能的細胞，再以非常有秩序的方式結合起來，而特化成各種組織與器官，進而形成個體。個體的一切表現必須受細胞中遺傳質體的支配，一旦細胞受損，在嚴重的情況下，細胞會死亡，輕者，細胞會起不正常的變化，進而影響其他的細胞、組織或器官，甚至整個個體。活體外細胞系的建立因不同的研究目的，將所需要的組織或器官從生物個體內取出，放在培養皿內（見圖一）；以生理食鹽水（0.9％ NaCl）沖洗，將一些不必要的組織去除乾淨，用剪刀或手術刀將剩餘所要的組織切成1立方毫米大小的碎片，再以生理食鹽水沖洗；然後把小碎片組織放到含有胰蛋白（trypsin）溶液的培養瓶內，在適當的溫室內振動30分鐘。胰蛋白能使細胞從組織上脫落而個別分開，接著將這些已分開的細胞製成細胞懸浮液，再由細胞懸浮液中取一些細胞接種於培養基內，置於37℃的恒溫箱（incubator）中培養。培養基內的細胞會附著在培養皿的表面，並生長、分裂、繁殖。如此能在培養皿中繁殖的細胞，稱為細胞系。由於細胞本身的代謝物不斷積存，而培養基內的營養物質也逐漸用盡，所以每隔一段時間必須將細胞從舊的培養培基內移植到另一新的培養基內，一般都是每隔三天轉移一次。依細胞的特質，有些細胞在有限次（小於70次）的移轉培養時就老化死亡，此謂有限生命細胞系。超過70次或無限次的移轉而能在實驗室中繁殖的稱為延續細胞系。細胞培養方法生物實驗室中常用的培養方法依其目的和特性可分三大類：器官培養（organ culture）、組織培養（tissue culture）、及細胞培養。其中以細胞培養最為困難，因為一般都以高等動物為研究的對象，其細胞都已高度特化，獨立性很弱，欲使其獨立生存繁殖，必須周詳考慮其生活所需之環境因子。培養細胞的方法一直是細胞生物學家探討的；若是個體所有部位的細胞都能在體外培養成功，對生物研究，醫學診斷與治療將是一大突破。目前自動物體內培養成的延續細胞系的數目如表一。依細胞的特性和實驗目的之需要而有不同的培養方式（見表二）。一個新的細胞系必須經過一些例行的分析步驟，確認為穩定後，才能應用到實驗之測試，圖二表示其例行工作。從引進新細胞以後，首先要大量繁殖，以穩定「量」的來源（1）；再將其中部分細胞冰凍在液態氮內，視必要時再解凍成新的來源（2）。量的來源穩定後，當求質的純化，使我們實驗用的細胞族群能為同一祖先細胞衍生而來。在表面積25平方公分的培養皿上，種植100個細胞，必須使其成為單細胞培養，經過7天左右的培養，每一單細胞會長成一群落（colony），而且此群落是由同一祖先細胞衍生而來的，以達到純化目的，此謂次營養系培養〔subclone，（3）〕。選取幾個生長良好的群落，做核型分析〔karyotype test，（4）〕，計算在100個細胞內每一種染色體數目所占的比例多少，用以說明實驗所用的細胞族群是基於何種比例的染色體數。量的穩定及質的確定後，就行一般例行培養（5），每三天移轉一次，期使細胞保持在最佳的生長狀況，以備實驗需要。在實驗測試之前，必須先做種植率分析〔plating efficiency test，（6）〕：一般理論，種值100個細胞，應該長成100個群落，但由於外界因素及細胞本身狀況，實際上收穫不到100個群落；而所收穫的群落數占種植細胞數的比率即為該細胞族群的種植率，以校正細胞的自然死亡。實驗測試後，細胞必須丟棄，下次實驗所需細胞的數量超過例行培養數，則必須重新解凍，再進行另一次的例行培養工作。實驗室的基本設備攝食及生長空間是生存的最基本條件，所以培養細胞最重要的是選擇適當的培養基（medium）和恒溫箱。目前實驗室內的細胞系都有其特定的培養基以及培養環境。一般的培養箱溫度都維持在37℃，所輸入的空氣中二氧化碳的量隨細胞系的不同而有差異，一般是在2～5％左右。觀察細胞活動及實驗結果最重要的工具是顯微鏡；顯微鏡可分為直立式（一般）顯微鏡和倒立式顯微鏡。細胞在培養皿內的生長活動情形，必須以倒立式顯微鏡觀察。因為一般直立式顯微鏡的物鏡與載物台間的距離，無法容納培養皿的高度，才發展出倒立式顯微鏡。兩者之差異是直立式的目鏡在物鏡之下，而倒立式顯微鏡剛好相反。觀察計算細胞染色體數目時，必須將細胞染色封片，而在直立式顯微鏡上觀察。精確計算細胞數目，在實驗上是相當重要的，尤其在計算種植率或細胞存活率時，更形重要。通常，要確定細胞數目必須利用細胞計數器，計數器可分為人工和機械式兩種；血球計數器是屬於人工式計數器，將細胞溶液滴在計數板上，再置於顯微鏡下計算。機械式是將細胞溶液置於電子計數器下，利用細胞撞擊電極而計數的方法。二者各有利弊，一般皆採兩者並用而互相驗證。細胞培養器具，可分為玻璃瓶和可棄式塑膠瓶。例行培養大都以玻璃瓶，實驗測試時才用可棄式塑膠瓶。細胞所需的培養基及其他添加物，都必須冷藏，所以冰箱和凍箱是實驗室必備的。而實驗器具和培養基都要求是無菌的，故消毒器也是不可或缺。器具的消毒是以高溫高壓滅菌器進行，培養基則是以過濾紙除菌。綜括以上所述，細胞實驗室的基本設備至少需要七項：培養基、恒溫箱、顯微鏡、細胞計數器、培養器具、冷藏設備（冰箱、凍箱）及消毒滅菌器。細胞系的應用細胞培養法在細胞生物學上的貢獻很大，隨著細胞培養法的進步，一些新設立的基礎醫學研究部門也相對的發展起來。細胞週期分析法、同步培養法等的改進，也同時對於該方面知識的發展有很大的助益。利用細胞融合和雜種形成的技術，把來自人類的淋巴細胞和小白鼠的細胞融合成為一個新的細胞，而使其不斷的增殖。製作染色體輿圖（chromosome map），解析遺傳因子呈現的機制及融合瘤（hybridoma）的形成。體細胞遺傳學（somatogenetics）、細胞工程學（cytoengineering）上，均可以細胞培養來作為研究的工具。另外原先認為無法再行分裂的小淋巴球，經過培養的結果卻發現，小淋巴球再受到各種刺激後仍可旺盛地分裂下去。此種淋巴球培養技術，除了在免疫學上以外，對於人類遺傳性疾病的了解也有很重要的應用。在病毒學的研究上，必須將寄主細胞控制於最單純的情形下進行細胞培養，而細胞系的培養技術近年來使得病毒在分子生物學上的研究，有著不可磨滅的貢獻。人類歷史上早已有毒性物質。近代人類文明進步後，製造許多化學物質及輻射線，對生物可能引起不良的影響，為了這方面的研究，細胞培養法提供了調查毒性時所需的簡便篩選法（screening），或作為探討毒性的機制。因此，它對於病毒學的研究是很重要的。參考資料 1. R.I. Freshney, “Culture of animal cells”, A Manual of Basic Technique, Department of Clinical Oncology Cancer Research Campaign Laboratories, University of Glasgow, Scotland. 2. J. Paul, Cell ＆ Tissue Culture, 5th Edition, Churchill Livingstone, Edinburgh London and New York, 1975. 3. FLOW Laboratories Catalogue, FLOW General Company. 4. M. M. Elkind, G. F. Whitmore, The Radiobiological of Cultured Mammalian Cells, New York, 1967. 5. E. J. Hall, Radiobiology for the Radiologist, New York, 1973. 鄧文炳任職於中山科學院
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